免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。流式細(xì)胞儀標(biāo)本制備的原理：活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測(cè)定的熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。

活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)－流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備

一、實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞樣品

二、試劑、試劑盒：兔血清、第二抗體、單克隆抗體、FCS-RPMI1640 DPBS

三、儀器、耗材：玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒光顯微鏡

四、流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備具體步驟：

1、收集細(xì)胞。上皮細(xì)胞需要蛋白酶消化，然后收集。加PBS或者流式洗液1ml，振蕩，1400rpm離心5min，棄上清。

2、染表型懸浮細(xì)胞于100ul體積，細(xì)胞濃度約為或者小于1X10^6，加入流式染色抗體。按照說(shuō)明書用量或者減半（根據(jù)經(jīng)驗(yàn)），分出一管作為同型。

3、4℃，避光30min，用PBS洗一遍，1400rpm離心5min，棄上清。

4、破膜破膜劑以BDpharmingen破膜劑為例，加300ul，4℃，避光30min以現(xiàn)配的破膜洗液1ml洗一遍。1400rpm離心5min，棄上清。

5、胞內(nèi)染色加入流式抗體4℃，避光30min。用破膜洗液1ml洗一遍，1400rpm離心5min，棄上清。

6、加入200ul1～2％多聚甲醛4℃避光保存。一般情況下，可直接把抗體加入到棄上清后的殘留液里（體積大概為50ul左右）。

五、流式細(xì)胞儀標(biāo)本制備注意事項(xiàng)：

1、整個(gè)操作在4℃下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaNO3，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落；

2、洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性；

3、加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

4、細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。

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